De Universiteit van Utrecht werd opgericht in 1636. Reeds drie jaar later kreeg de universiteit, op het bolwerk Sonnenborgh, haar tuin. Dat was toen nog een Hortus Medicus, vooral bedoeld om de studenten kennis te laten maken met medicinale planten en kruiden.
In 1723 verhuist de Hortus naar een terrein tussen Nieuwegracht en Lange Nieuwstraat, waar Joseph Serrurier (1668-1742) een systematische tuin aanlegt in navolging van de Leidse hoogleraar Herman Boerhaave. Deze tuin, nu bekend als de Oude Hortus, wordt tot ver in de twintigste eeuw regelmatig uitgebreid en veranderd, maar in 1987 opgeheven.
In 1963 vond de aankoop plaats van het "Werk aan de Hoofddijk" in De Uithof. Daarmee volgde de botanische tuin de beweging van de universiteit richting De Uithof. Het militaire werk aan de Hoofddijk was een fortificatie van de in onbruik geraakte Oude Hollandse Waterlinie. De locatie wordt daarom kortweg als Fort Hoofddijk aangeduid.